Theorie:
Die DNA Sequenzierung ist eine Methode, um die Sequenz (Abfolge) der Basen der DNA zu bestimmen.
Die häufigst angewandte Methode ist die Sanger-Methode. Sie wird inzwischen automatisch von Geräten durchgeführt.
Sie läuft wie folgt ab:
- Der DNA-Doppelstrang wird durch Erhitzen in zwei Einzelstränge getrennt.
- Es werden Primer gesetzt. Dies sind kurze DNA-Einzelstränge, die der DNA-Polymerase anzeigen, wo sie mit der DNA-Synthese beginnen soll.
- Es werden spezielle Nukleotide produziert, die je nach Base gefärbt sind (z. B. rot = Thymin, usw.). Sie haben außerdem die Eigenschaft, dass sie die DNA-Synthese der Polymerase beenden, wenn sie eingebaut werden.
- In ein Reagenzglas kommen
a) DNA-Einzelstränge mit gesetzten Primern
b) DNAPolymerase
c) normale Nukleotide
d) gefärbte Nukleotide - Die Nukleotide werden von der Polymerase eingebaut. Dabei dienen die Einzelstränge jeweils als Vorlage.
- Ob ein normales oder ein gefärbtes Nukleotid verwendet wird ist reiner Zufall.
- Nach jedem gefärbten Nukleotid bricht die Synthese ab. Jeder neue Strang ist daher unterschiedlich lang und enthält nur ein einziges gefärbtes Nukleotid.
- Mittels Gel-Elektrophorese werden die DNA-Stücke voneinander getrennt. Dabei wandern die DNA-Stücke in einer Gel-Schicht entlang, wobei die kürzeren Stücke schneller wandern als die längeren. Sie werden also nach Größe sortiert.
- Die Auswertung erfolgt nun nach Größe und Farbe. Das kürzeste DNA-Stück ist nur ein einziges Nukleotid lang. Die Polymerase hat als erste Base gleich ein gefärbtes Nukleotid verwendet. Anhand der Farbe kann nun die erste Base der DNA bestimmt werden (z. B. rot = Thymin). Das nächst größere Stück ist zwei Nukleotide lang. Anhand der Farbe des Stücks kann die zweite Base der DNA bestimmt werden. Auf diese Weise kann in mühevoller Kleinarbeit das gesamte DNA-Stück, welches Millionen von Basen enthalten kann, sequenziert.
Frederick Sanger
Wichtig!
Durch DNA-Sequenzierung wird die Basenabfolge einer DNA bestimmt.
Quellen:
Ruso, Bernhart. 2011. BIOLOGIE. Skriptum. Wien: Dr. Roland GmbH, 2011. 3.Auflage
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Didesoxy-Methode.svg
https://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Frederick_Sanger2.jpg&filetimestamp=20061006040855